📻 KTO CHCE WIEDZIEĆ O TOBIE WSZYSTKO? Genom polem zimnej wojny

AUDIO REO. Posłuchaj nagrania tekstu, czyta Danuta Stachyra. 14’07”

 


Ludzkość od niepamiętnych czasów i próbuje szyfrować informacje, i zmaga się z ich odczytaniem. Rządy wielu państw przeznaczały niemałe środki na to, by opracować kody, których nikt nie mógłby złamać. I choć znamy z historii choćby szyfr Cezara, Ramsaya czy Enigma, to jednak nie ulega żadnej wątpliwości, że jednym z najtrudniejszych i najcenniejszych jest nasz własny szyfr – kod DNA.

Kod genetyczny człowieka
Kod DNA to występujące po sobie kolejno nukleotydy kodujące w pierwszym etapie transkrypt, z którego następnie w procesie translacji powstają funkcjonalne cząsteczki naszego organizmu – białka. Składa się z dwóch nici białek. DNA przybiera formę podwójnej, prawoskrętnej helisy. Zbudowane jest z zasad azotowych połączonych wiązaniami wodorowymi oraz reszt fosforanowych i reszt cukrowych połączonych wiązaniami fosfodiestrowymi, tworząc w ten sposób podstawową cegiełkę – nukleotyd. Całe DNA określa się jako genom człowieka. Genom zbudowany jest z 3miliardów par zasad, a ich miejscem jest jądro komórkowe.

Właśnie w DNA zapisane są tak istotne informacje, jak cechy zewnętrzne, grupa krwi, podatność na choroby, tempo starzenia i wszystkie inne cechy decydujące o naszej biologii. DNA jest nośnikiem naszej informacji genetycznej. Jednak aby z jego dwuniciowych struktur można było się dowiedzieć tych wszystkich ważnych rzeczy, należy w jakiś sposób odczytać te cenne informacje, a to nie jest proste zadanie. Na samym początku trzeba zmierzyć się z sekwencjonowaniem genomu – odczytaniem sekwencji DNA, czyli kolejnych występujących w nim nukleotydów.

Wyścig deszyfrantów
W 1990 roku rząd USA przeznaczył 3 mld dolarów na projekt poznania ludzkiego genomu. Założono, że dzięki pracy naukowców z wielu krajów do roku 2005 uda się poznać cały ludzki genom. Oprócz uczonych ze Stanów Zjednoczonych do prac przyłączyły się Chiny, Japonia, Wielka Brytania, Francja i Niemcy. Prace ukończono dwa lata przed czasem, gdyż w tym samym czasie, amerykański biotechnolog i przedsiębiorca, Craig Venter założył firmę Celera Genomics, która również za cel obrała sobie zsekwencjonowanie genomu człowieka, by potem to osiągnięcie wykorzystać komercyjnie, a to oznaczałoby, że wszelkie korzyści z poznania genomu ludzkiego, w tym leków opracowanych dzięki tej wiedzy, płynęłyby tylko i wyłącznie do Craiga Ventera, który w taki sposób mógł zmonopolizować rynek farmaceutyczny na całym świecie.

Do 2003 roku oba zespoły poznały 90% ludzkiego genomu, ale przez to, że stosowały różne techniki badawcze, to prace te uzupełniają się wzajemnie. Poznanie sekwencji genomu to jedno, ale odróżnienie poszczególnych genów i poznanie ich funkcji to już co innego, bowiem my, ludzie, posiadamy w genomie introny, czyli sekwencje niekodujące (co nie oznacza, że nie spełniają żadnej funkcji), które należy oddzielić od eksonów, czyli odcinków kodujących geny. Badaniem poszczególnych genów, ich funkcji i oddziaływań zajmuje się dziedzina nauki zwaną transkryptomiką.

Nadzieja diagnostyki
Obecnie w grę wchodzą metody sekwencjonowania wysokoprzepustowego nowej generacji (NGS). Są one w stanie w krótkim czasie i relatywnie niewielkimi kosztami przeprowadzić sekwencjonowanie o wysokiej wydajności. Szczególnie nadzieje wiąże się z diagnostyką, bowiem właśnie pod kątem wielu schorzeń związanych z naszym genomem możemy zsekwencjonować i przeanalizować swój genom. Jedną z bardziej wdzięcznych chorób do diagnozowania tą metodą jest zespół Alporta, objawiający się uszkodzeniami nerek, narządu słuchu oraz wzorku. Jest to choroba autosomalna recesywna i sprzężona z płcią. Tradycyjna diagnostyka jest uciążliwa i w najlepszym przypadku trwa przynajmniej kilka miesięcy. Dzięki NGS możemy natychmiast chorobę wykryć, a dodatkowo zbadać wszystkie możliwe warianty w innych genach.

W systemach sekwencjonowania nowej generacji tworzona jest najpierw biblioteka badanych odcinków DNA, czyli fragmentujemy całe DNA na znanej długości kawałki następnie zachodzi powielenie tych fragmentów według schematu znanego z poprzednich metod, aż w końcu dochodzi do masowej identyfikcacji sekwencjonowanego DNA.

Początki sekwencjonowania
Pierwszej udanej próby opisania genomu dokonał w 1977 roku Frederick Sanger, za co w 1980 roku zdobył Nagrodę Nobla (ale zaznaczam, że nie był to genom człowieka, na to wydarzenie musieliśmy jeszcze trochę poczekać; Sanger zsekwencjonował genom pewnego faga – wirusa atakującego bakterie). Mechanizm tej reakcji polegał na budowaniu nici DNA in vitro przez enzym katalizujący dobudowywanie do niej kolejnych nukleotydów – polimerazę DNA.

Enzym ten w naturalnych warunkach przeprowadza reakcje zachodzące w naszych komórkach, takie jak stałe powielanie materiału genetycznego, ale może też charakteryzować się zdolnościami naprawczymi w stosunku do sekwencji nukleotydów budujących DNA. Do probówki reakcyjnej dodawano trifosforany dideoksynukleotydów, które są odpowiednio na potrzeby reakcji sztucznie zmodyfikowanymi nukleotydami. Po włączeniu do łańcucha DNA uniemożliwiały one dalsze wydłużanie nici. W taki sposób otrzymywano fragmenty DNA o różnej długości. Zobrazować je można na żelu elektroforetycznym, gdzie rozdział odbywa się pod względem wielkości uzyskanych fragmentów, i na tej podstawie można ocenić, jaka jest kolejność poszczególnych nukleotydów w łańcuchu. Metoda Sangera jest dosyć czasochłonna – i obecnie wypierana przez nowsze.

Niemal równolegle prace nad inną metodą, zwaną metodą chemicznej degradacji DNA, prowadzili Walter Gilbert i Allan Maxam. Upraszczając, w tej technice modyfikowano pewne zasady azotowe budujące DNA, a potem nić przecinano w ściśle określonym miejscu i na tej podstawie określano sekwencję DNA. Obie metody w znaczny sposób przyczyniły się rozwoju genetyki i stawiały nie tylko przed naukowcami, ale i przed całym światem nowe wyzwania. Od tamtego momentu zaczęto intensywnie pracować nad nowymi, szybszymi i wydajniejszymi metodami sekwencjonowania, choć główna zasada działania sekwencjonowania się nie zmieniła i w dużej mierze nadal bazuje na metodzie Sangera.

Komputer na straży wyników
Oczywiście głównym celem rozwoju tych wszystkich technik było zsekwencjonowanie ludzkiego genomu. Ma on około 3 miliardów par zasad, więc posłużenie się do tego starą metodą Sangera przysporzyłoby wielu problemów. W dobie komputeryzacji i automatyzacji opracowano nowe techniki, które pozwalają w znacznie krótszym czasie zsekwencjonować znacznie więcej materiału genetycznego przy jednoczesnej eliminacji ewentualnego błędu człowieka podczas odczytywaniu wyników procesu.

Jedną z nich jest sekwencjonowanie automatyczne oparte na znakowaniu fluorescencyjnym. Tutaj znakujemy dideoksynukleotydy różnymi fluorochromami, czyli tak jakby kolorujemy na różne kolory nukleotydy, które wbudowują się do sekwencjonowanych fragmentów nici. I co ważne, danym kolorem oznaczony jest jeden typ nukleotydu, np. na czerwoną barwę zyskuje guanina, która zgodnie z zasadą komplementarności przyłącza się do cytozyny. Poszczególne kolory rozpoznawane są przez detektor, z którego w naszym przypadku w tym momencie wypływa sygnał o przyłączeniu czerwonego nukleotydu, czyli guaniny, zatem wiemy, że w tym miejscu została wykryta cytozyna. W trakcie trwania całej reakcji komputer rejestruje wszystkie impulsy po kolei, analizuje i przedstawia gotowe wyniki na ekranie, co jest nie tylko wygodne, ale także znacznie podwyższa wydajność reakcji.

Kolejna metoda, która również jest zautomatyzowana, to pirosekwencjonowanie. Głównym reagentem (substancją, która bierze udział w danej reakcji) jest enzym lucyferaza. Podczas przyłączania kolejnych nukleotydów uwalniany jest pirofosforan, będący związkiem fosforu. Włączany jest on do reakcji produkcji ATP – uniwersalnego nośnika energii w komórkach wszystkich organizmów żywych (energia zmagazynowana jest w wiązaniach między wspomnianymi resztami fosforanowymi). Następnie dzięki lucyferazie ATP jest przekształcane do AMP (także nośnik energii, ale już zubożony o dwie reszty fosforanowe, więc związek ten jest dużo mniej energetyczny) i w tym momencie mamy do czynienia z uwolnieniem kwantu światła, które jest rejestrowane i przesyłane do komputera, a wyniki takiego sekwencjonowania możemy na bieżąco podglądać.

Jeszcze inną metodą jest sekwencjonowanie oparte na hybrydyzacji, czyli przyłączaniu jednych odcinków DNA do innych. Reakcja bazuje na microchipach – płytkach, na które naniesione zostały oligonukleotydy, czyli większe fragmenty DNA, a do nich mogą się przyłączyć sekwencjonowane odcinki DNA. Na podstawie tego, do których oligonukleotydów przyłączyły się badane fragmenty, można określić sekwencję badanego DNA. Praca manualna przy tej metodzie ogranicza się jedynie do naniesienia na chip badanej sekwencji, resztę wykonuje komputer.

Projektowanie inteligencji
Korzyści płynące z możliwości sekwencjonowania ludzkiego genomu są oczywiste. Zaczynając od lepszego poznania własnych molekularnych mechanizmów rządzących całym organizmem, poprzez lepsze poznanie genów, na diagnostyce złożonych chorób kończąc. Ale pojawia się też wiele zagrożeń. Dane genetyczne są danymi wrażliwymi, w skrajnym przypadku firmy ubezpieczeniowe mogłyby uzależnić finansowanie ubezpieczenia od wyników badań genetycznych klienta. Jeżeli z analizy wynika, że jest bardziej podatny na ciężkie choroby, musiałby on zapłacić wyższą składkę.

Ten scenariusz jest na szczęście tylko teoretyzowaniem, ale Chiny, które pragną być mocarstwem w każdej dziedzinie, postanowiły to osiągnięcie wykorzystać w dosyć kontrowersyjnym celu. Zlecono bowiem zbadanie genomu 2 tysięcy najinteligentniejszych ludzi, by poznać regiony DNA odpowiedzialne za inteligencję. W taki sposób metodami inżynierii genetycznej planują projektować zarodki, z których mają szansę rozwinąć się najinteligentniejsze dzieci. Nie trzeba chyba dodawać, że krajem, który obecnie przoduje w metodach i cenie sekwencjonowania są właśnie Chiny. Czy działania tego kraju są etyczne? Kwestia dyskusyjna, ale póki reszta świata czeka z założonymi rękoma nie rozwijając technik sekwencjonowania i inżynierii genetycznej to poddajemy się walkowerem, bo chyba nie jesteśmy świadomi tego, że jesteśmy w trakcie swego rodzaju zimnej wojny, ale tym razem naszą bronią jest wiedza i nauka.